來源頭條作者:合木千行技術團隊概述

基因測序可以分為“濕”實驗和“干”實驗兩個階段。其中“濕”實驗指的是將待測樣本利用實驗室方法進行核酸提取、文庫構建（包括片段化、富集、擴增等一系列過程）到完成上機測序的實驗過程，而“干”實驗則是從得到下機數據開始，到完成生信分析和報告解讀的整個過程。可以認為“濕“實驗是對樣本的處理，”干“實驗是對數據的處理。上機測序是介于“濕”和“干”實驗中間的重要環節，其中“機”指的是測序儀，它通過測序技術將熒光信號轉化成特定的ACGT四種堿基序列，完成從樣本中讀取遺傳信息的任務。自20世紀70年代以來，測序技術不斷發展升級，經歷了多次技術革命，從第一代發展到了第三代測序技術，其通量和準確性不斷提高，成本也在不斷降低。

生物信息分析是一個利用計算機科學和生物信息學工具、方法和技術，來對生命科學數據進行分析和研究的領域。廣義來講，根據其分析的側重和所處的階段可以被劃分為一級、二級、三級分析。其中，一級分析指的是將熒光信號轉化成堿基序列，完成堿基識別的過程；二級分析則是針對測序下機的堿基序列數據進行生物信息學計算的過程；最后，三級分析涉及到對二級生物信息分析的結果進行進一步解讀的過程。

一級分析

一級分析是利用測序技術將熒光信號轉換成四種堿基信號的過程，主要是basecall軟件通過堿基判讀技術和算法，從原始圖像中識別出堿基類型，將結果寫入cal文件，最終生成測序報告和FastQ數據。目前MPS技術的主流測序廠商illumina和MGI華大智造的測序系統，根據測序所使用的熒光種類數量的不同，可劃分為Four-Color、Two-Color和One-Color技術，三者的測序成本、準確性和錯誤偏向都有其特點。以Two-Color為例，指用2種類型的熒光代表4種堿基，為了避免光譜crosstalk，選用的是紅、綠兩種熒光，不發光代表G堿基，紅光代表A堿基，綠光代表C堿基，同時發出紅綠光的代表T堿基。目前常見的basecall算法，利用對光學系統捕獲的光信號或直接從拍照的圖像出發，有利用先驗數值校正后基于半監督的分類進行堿基判讀，也有基于機器學習方法進行堿基判讀等。

二級分析

什么是二級分析

生物信息學涉及領域廣泛、研究的側重點也不同，是一門交叉學科。通俗地講，生物信息分析指的是利用計算機對生物大數據進行操作，包括但不僅限于讀取、整理、分析和傳播等。所謂二級分析，是在一級分析下機數據的基礎上，對數據進行更深入的處理，以獲得有意義的結果，包括進行序列質量控制（去除低質量序列和去除接頭序列等）、序列比對、基因表達分析和變異檢測等。二級分析的數據有三種常見類型：DNA數據、RNA數據和蛋白數據。

1、DNA數據

DNA數據的獲得一般是通過將DNA片段化后進行擴增測序得到，包括：全基因組測序（WGS）、全外顯子測序（WES）和靶向PCR擴增測序等。DNA分析通常關注motif、基因、點突變、InDel、拷貝數和結構變異等。

2、RNA數據

RNA 數據的獲得需要先將RNA逆轉錄為cDNA后再對cDNA進行擴增測序，測序內容是RNA上的遺傳信息。依據不同的種類RNA、建庫方式等包括：小RNA測序（smallRNA）、轉錄組測序（mRNA）、長鏈非編碼RNA測序（lncRNA）、單細胞RNA測序（scRNA）等。RNA 分析通常關注基因表達、共表達、差異基因、互作方式、時序分析等。

3、蛋白數據

隨著質譜技術的進步，對樣品中的多個蛋白質進行高通量鑒定已經成為可能。蛋白質組學是一門研究蛋白質組的學科，不僅涉及蛋白的定性和定量，還包括定位、修飾、相互作用、結構、活性和功能分析。與基因組不同，蛋白質組的組成會隨著時間和整個生物體的變化而不斷發生變化。

如何進行二級分析根據不同的分析目的，分析方法也不盡相同，需要具體情況具體分析。 以DNA數據進行WGS分析為例，主干分析流程包含數據質控、比對、突變檢測(snp、InDel)、拷貝數變異、結構變異等。而主干流程，每一步步驟用到的方法有許多選擇，如數據質控依據測序數據來源特征、序列分布均勻性、插入片段長度分布、數據堿基分布特征、不同的堿基質控方法等因素可選用不同的質控軟件、程序對比進行。二級分析往往還需要整合、注釋公開的標準數據庫內容，因此二級分析也需要熟悉使用各類常見數據庫。以下是一些常見的大名鼎鼎數據庫：

Refseq：NCBI Reference Sequence Database，意圖是為所有常見生物提供非冗余，人工選擇過的參考序列。

GenBank: Genetic sequence database from NCBI ，常用于下載參考基因序列或者上傳新測序的數據。GenBank上序列比較全面，與RefSeq 的主要區別在于RefSeq經過了去冗余與檢驗，可信度比GenBank高。

UniProt: Protein sequence database，常用于獲取蛋白序列，蛋白質組學分析需要用到。

GEO Database: Gene expression profiles from NCBI，含有已分析數據集的基因表達結果，常用于數據挖掘。隨著數據庫的流行，逐漸擴展業務到許多其它的高通量數據，比如：甲基化，染色質結構，基因組-蛋白交互作用等。

Expression Atlas: 提供了不同物種、不同生理條件的基因表達數據。

三級分析

什么是三級分析所謂的三級分析，通常也叫“遺傳分析”，是指結合患者臨床信息，對二級分析后的檢測結果進行臨床意義的解讀，并出具檢測報告。在臨床診療領域，目前應用比較多的主要還是DNA數據，所以接下來我們重點介紹DNA數據結果的解讀分析。

如何進行三級分析1、數據篩選

經過二級分析后，我們會得到樣本的變異檢測結果。以遺傳病領域目前比較流行的全外顯子組測序 (WES)為例，平均每個樣本會產生幾千甚至上萬個變異，這些變異首先需要按照一定的規則進行過濾篩選（比如去掉高人群頻率的變異；同義突變因為并不改變蛋白質序列，普遍認為不會產生突變效應，一般也不予解讀），剩下的罕見變異再進行進一步的分析解讀。腫瘤精準治療基因檢測項目的變異數量一般要少的多，但也需要進行過濾。

2、制定解讀規則

檢測結果經過上述初步的篩選后，需要按照規則對剩下的變異進行詳細的解讀，雖然各家檢測機構在解讀細則上會略有不同，但都需要遵循一些普遍的通用規則。針對遺傳病領域檢出的胚系突變，應按照ACMG的胚系突變解讀流程進行注釋及解讀。基于當前證據將胚系變異的致病性分為五個等級：致病、可能致病、意義不明確、可能良性和良性。針對腫瘤精準治療領域常見的體細胞變異，目前比較受認可的是2017年美國分子病理學協會（AMP）/美 國 臨 床 腫 瘤 學 會（ASCO）/美 國病 理 學 家 協 會（CAP）聯合制定的體細胞變異解讀指南，將體細胞變異分為Ⅰ類具有重要臨床意義的變異、Ⅱ類具有潛在臨床意義的變異、Ⅲ類臨床意義不明的變異和Ⅳ類無害或可能無害的變異。

3、結合解讀知識庫對結果進行臨床意義的解讀

人類大約有2萬多個基因，其中目前已知的跟遺傳病和腫瘤相關的基因就有數千種，這些基因分別是什么功能，與什么疾病相關。每一個基因的位點多則成千上萬個，變異可能發生在任何一個位點，某個位點發生變異后功能是受到激活還是抑制，與什么藥物相關，是導致敏感還是耐藥等等。上述這種臨床意義的解讀需要一個龐大的解讀知識庫的支持。臨床解讀知識庫的構建需要整合當前公共數據庫、指南共識及已發表文獻的海量信息。

4、解讀結果如何展示（報告模板）

變異結果有了，也知道它的臨床意義了，怎么展示給受檢者和醫生，需要一份對普通大眾閱讀友好的報告對結果進行展示，幫助受檢者簡單、快速的理解檢測結果。同時，也需要明確說明檢測范圍和以及檢測存在的局限性，并告知該檢測在臨床中發揮的角色（不可直接用于診療，而是輔助臨床醫生進行診療決策）?；谌娴慕庾x知識庫和嚴格的循證分級系統，遺傳分析人員對檢測出的變異進行篩選和評估，確定其可能的致病性和臨床意義，并據此出具通俗易懂的檢測報告。臨床醫生再結合受檢者的家庭史、臨床表現、生化指標、影像學等綜合信息，進行最終的解讀和診療建議。

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